1. 서론
2. 재료 및 방법
2.1 시료 채취
2.2 Sieving method를 통한 와편모조류 시스트 분석
2.3 Palynological method를 통한 와편모조류 시스트 분석
3. 결과
3.1 와편모조류 시스트의 현존량
3.2 와편모조류 시스트 종조성
4. 고찰
1. 서론
해양환경 변화를 추정 하는데 이용되는 와편모조류 시스트는 퇴적물 분석을 통해 관찰 할 수 있다. 퇴적물에는 와편모조류 시스트 뿐만 아니라 해양과 육상에서 기원이 되는 다양한 유기물과 규조류 등의 입자가 있어, 와편모조류 시스트를 관찰하기 위해서는 이들을 제거하고, 농축하는 과정이 필요하다(Matsuoka and Fukuyo 2000; Hallegraeff 2003). Matsuoka and Fukuyo (2000)는 sieving method와 palynological method의 두 가지 시료전처리 방법을 통해 시스트 관찰에 방해되는 요인을 제거할 수 있다고 보고하였다. 이 중, sieving method는 산 처리를 하지 않고 sieving과 초음파 처리를 이용하여 시스트를 저질에서 분리하는 방법이며(Wall and Dale 1968), palynological method는 염산(HCl) 및 불산(HF)을 이용하여 퇴적물내 유기물과 규조류를 제거한 후, 시스트 종조성과 분포를 알아보기 위해 고안되었다(Dale 1979). 현재까지 국내의 와편모조류 시스트 분포 연구는 대부분 palynological method으로 연구가 진행되어 왔다(Cho and Matsuoka 2001; Cho et al. 2004; Pospelova and Kim 2010; Shin et al. 2011). 하지만 Reid (1974)는 시료처리 과정에서 사용되는 산에 의해 시스트가 손상될 수 있으며, 시료처리 방법에 따라 퇴적물내 출현하는 분포가 다를 수 있음을 제시하였다. 또한 Dale (1979)은 산 처리의 효과로 퇴적물내 스포로폴레닌(sporopollenin) 성분과 같은 단단한 organic-walled 시스트는 남아있지만, 저항성이 약한 일부 시스트들은 형태가 변형되거나 소실 될 수 있다고 하였다. 이와 같이, 오래전부터 시료처리 방법에 의해 소실되는 시스트가 있을 가능성을 제시되었지만, 현재까지 표층퇴적물내 시스트 관찰을 위한 적합한 전처리 방법에 관해서는 많은 논쟁이 있다. 와편모조류 시스트는 연구해역의 해양환경 특성을 이해하는데 중요한 생물학적 지표로서 활용되며(Zonneveld et al. 1999), 이를 위해 정확한 시스트 군집 파악이 중요하므로 표층 퇴적물내 시스트 분포 조사 시 적합한 시료처리 방법을 확인할 필요성이 있다. 따라서, 본 연구에서는 동중국해 북부해역와 제주도 해역에서 확보한 표층퇴적물을 대상으로, palynological method과 sieving method의 두 가지 시료전처리 방법을 적용하여 와편모조류 시스트 분포 특성을 비교 분석하였고, 이를 통해 표층퇴적물 내에 존재하는 와편모조류 시스트 분석에 적합한 시료처리 방법을 제안하고자 한다.
2. 재료 및 방법
2.1 시료 채취
표층퇴적물 내 와편모조류 시스트 확보를 위해 2015년 6월과 2017년 4월에 총 2회에 걸쳐 동중국해 북부와 제주도 해역에서 표층퇴적물을 확보하였다(Fig. 1). 와편모조류 시스트 표본 채집은 박스 코어를 이용하여 표층퇴적물을 채집한 후, 시료의 표층 2 cm를 밀폐용기에 취하여 분석 전까지 냉암소에 보관하였다.
2.2 Sieving method를 통한 와편모조류 시스트 분석
Sieving method는 Matsuoka and Fukuyo (2000)가 제안한 과정으로 진행 하였다. 즉, 혼합된 표층퇴적물 시료를 2 g 분취하여 100 ml 비이커에 여과해수를 넣고 혼합한 후 시스트에 붙은 유기물을 제거하기 위해서 초음파 분쇄기(sonicator)로 30초간 조사하였다. 처리된 시료는 128 μm와 10 μm의 중첩된 시브(sieve)에 통과시켜 유기물을 제거하고, 10 μm 시브 위에 남겨진 시료는 샤레(petri dish)로 옮겨 여과해수를 사용하여 패닝(panning)을 형성시켰다. 그리고 표층수만을 포집하여 미세사질을 제거한 후 여과해수를 첨가하여 최종 농도 10 ml로 되도록 하였고, 빛이 통하지 않는 갈색의 유리 바이알에서 냉장 보관(약 4℃)하였다. 와편모조류 시스트 분포를 알아보기 위해 도립현미경을 이용하여 정량 분석을 실시하였다. 시료 1 ml을 Sedwick-Rafter chamber에 분취한 후, 광학현미경(ECLIPSE Ni-U, Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 200~400배의 배율 아래에서 시스트를 관찰하였다. 농도환산을 위해 퇴적물 시료의 일부분을 분취하여 무게를 측정하고 드라이오븐(dry oven)으로 45℃의 온도에서 24시간 동안 건조시켜 다시 무게를 측정하였다. 그리고 건조 전 무게와 건조 후 무게의 차를 이용하여 함수율을 계산하였다. 계수된 와편모조류 시스트의 농도는 퇴적물의 함수율을 사용하여 건중량당 개체수(cysts g-1 dry)로 환산하였다.
2.3 Palynological method를 통한 와편모조류 시스트 분석
Palynological method는 다음과 같이 진행 하였다. 혼합된 시료 5 g를 분취하여 45℃에서 24시간동안 건조시킨 후 무게를 측정하여 함수율을 계산하였다. 그 후 건조된 시료에 tablets (Lycopodium spores : 20,848)과 15%의 염산(HCl)을 첨가하고 혼합시켰다. 혼합된 시료는 실온의 후드 안에서 30분간 방치하여 퇴적물내 유기물을 용해시켰다. 시료는 원심분리기를 이용하여 3000 rpm에서 10분간 회전시켜 시료를 침전시켰으며, 이 후 상등액을 제거하고 시료에 증류수를 넣어 중성화를 수 회 동안 실시하였다. 중성화된 시료에 50%의 불산(HF)을 첨가하여 실온의 후드 안에서 30분간 방치하여 미세사질 및 규조류 외각(diatom frustules)등의 규산질 입자를 용해시켰다. 그리고 시료가 중성이 될 때까지 증류수를 이용하여 수 회 세척을 실시하였다. 중성화된 시료는 초음파 분쇄기로 30초간 조사하였고, 초음파 처리된 시료는 128 μm와 10 μm의 중첩된 체에 통과시켜 시스트 크기 외의 퇴적물을 제거하였다. 그리고 10 μm의 체에 올려진 시료는 50 ml 튜브에 옮겼다. 현미경 관찰을 위한 표본 제작은 50 ml 튜브안의 시료 한 방울을 분취하여 slide glass에 올려놓고 가열된 glycerine jelly와 혼합하였다. 혼합된 시료에 cover slip을 덮고 실온에서 10분간 방치시켜 표본을 제작하였다. 제작된 표본은 광학현미경(ECLIPSE Ni-U, Nikon, Tokyo, Japan)의 200배와 400배의 배율 아래에서 종 동정 및 정량분석을 실시하였으며, Mertens et al. (2009)의 검경법을 참고하여 시스트는 정점별 최소 300개 이상을 계수하였다. 단 시스트의 농도가 적은 정점은 Price et al. (2016)의 검경법에 따라 slide glass 표본 최소 10개를 계수하였다. 계수된 시스트 농도는 아래의 Benninghoff (1962)의 계산식을 통해 건중량당 개체수(cysts g-1 dry)로 환산하였다.
c: 시스트의 개체수 / g·dry
dc: 관찰된 총 와편모조류 시스트의 수
Lt: 20,848 Lycopodium spores / tablet
t: 첨가된 tablet의 개수
Lc: 관찰된 총 Lycopodium spores 수
w: 퇴적물의 건중량(g)
본 연구에서 우점종은 정량을 통해 나타난 상대적 결과 값을 통해 결정되었다.
3. 결과
3.1 와편모조류 시스트의 현존량
동중국해 북부해역과 제주도 해역의 표층퇴적물을 palynological method와 sieving method으로 처리 하였을때 나타난 현존량 차이를 Fig. 2에 나타내었다. Palynological method을 이용하였을 때 동중국해북부해역에서 나타난 시스트 현존량은 110~1,565 cysts g-1 dry로 평균적으로 정점 당 546 cysts g-1 dry로 나타났으며, 제주도 위쪽에 위치한 E3 정점에서 1,565 cysts g-1 dry로 가장 높은 시스트 현존량이 나타났으며, 정점 E7에서는 낮은 시스트 현존량을 보였다.
Sieving method을 이용하여 시료를 처리하였을 때에는 정점당 평균 14,808 cysts g-1 dry의 현존량을 보였으며, E12 정점에서 가장 높은 현존량(43,167 cysts g-1 dry)을 보였고, 정점 E9에서 가장 낮은 현존량(4,041 cysts g-1 dry)을 보였다. Palynological method와 비교하면 sieving method을 이용한 와편모조류 시스트의 정점별 평균 현존량은 palynological method보다 27배 높았고, 가장 높은 현존량을 보이는 정점에도 차이가 있었다.
3.2 와편모조류 시스트 종조성
동중국해 북부해역과 제주도 해역의 표층퇴적물을 palynological method과 sieving method과의 방법으로 처리하여 관찰한 와편모조류 시스트 종조성에 대해, 정점별 출현 종수는 Fig. 3에, 두 방법에서 나타난 출현종의 우점율은 Table 1에 나타내었다.
Palynological method을 이용하여 시스트를 관찰하였을 때 전체 정점에서 11속 15종의 와편모조류 시스트가 출현하였으며, calcareous-walled 시스트는 오직 정점 E6에서만 출현하였고, 나머지는 모두 organic-walled 시스트로 나타났다. 그 중 독립영양 와편모조류 시스트는 8속 11종이 나타났으며, 종속영양 와편모조류 시스트는 3속 4종이 나타났다. 퇴적물을 palynological method을 통하여 시료처리 하였을 때, 정점당 와편모조류 시스트의 출현 종수는 평균 5종으로 나타났으며, 제주도 위쪽에 위치한 E6 정점에서 8종으로 가장 많은 종이 출현하였으며, E12 정점에서 2종으로 가장 낮은 출현을 보였다.
퇴적물을 sieving method으로 처리하였을 때, 전체 정점에서 16속 20종의 와편모조류 시스트가 출현하였으며, calcareous-walled 시스트인 Thoracosphaera heimii는 모든 정점에서 출현하였고, 90% 이상의 우점율을 보였다. 이 시스트는 구형을 하고 있으며, 내부에 붉은색 red body를 가지고 있으며, 외벽에는 poroid가 관찰된다(Fig. 4). 정점당 출현 종수는 평균 7종으로 나타났으며, E4 정점에서 11종, E9 정점에서 10종으로 높은 종다양성을 보였고, E11과 E12 정점에서 5종으로 가장 적은 출현 종수를 보였다. 독립영양 와편모조류 시스트는 12속 15종이 나타났으며, 종속영양 와편모조류 시스트는 4속 5종이 나타났다.
Table 1.
Percentage (%) of the dinoflagellate cyst taxa resulted from two different methods.
Fig. 4
Light microscopy (A, B) and scanning electron microscopy (C, D) photographs of Thoracosphaera heimii observed in surface sediments from Korea coastal area and East China Sea. Red and yellow heads indicate red body and poroid, respectively. Scale bars represent 10 μm unless otherwise indicated.
퇴적물을 palynological method와 sieving method으로 처리하였을 때의 결과를 비교해 보면, 정점 당 출현하는 종수는 E6 정점을 제외한 대부분의 정점이 palynological method보다 sieving method을 통해 알아보았을 때가 더 높게 나타났다. Palynological method을 이용하여 퇴적물에서 출현하는 와편모조류 시스트의 우점율을 알아본 결과, Spiniferities spp.가 전체 출현한 군집의 52.89%로 제 1우점종을 차지하였고, Brigantedinium spp.이 30.08%으로 제 2우점종을 차지하였다(Table 1). 그리고 Tuberculodinium vancampoae가 3.41%의 우점율을 보였으며, Quinqucuspis concretum, Selenopemphix quanta, Operculodinium centrocarpum, Cyst of Alexandrium catenella/pacificum complex, Lingulodinium machaerophorum이 각각 2.86%, 2.31%, 2.03%, 1.88%, 1.04%의 우점율을 보였다. 퇴적물을 sieving method으로 처리하였을 때, T. heimii이 제 1우점종으로 91.57%의 우점율을 보였고, 그 다음으로는 제 2우점종은 Leonella granifera와 제3 우점종은 Calciodinellum levantinum 시스트가 각각 2.45%와 2.15%의 우점율을 보였다.
4. 고찰
표층 퇴적물에는 와편모조류 시스트 외에도 다양한 유기물 등이 있어, 이를 제거하고 시스트를 농축 할 수 있는 시료 전처리 방법이 필요하며, 현재 palynological method이 주로 사용되고 있다(Matsuoka and Fukuyo 2000). Palynological method은 염산과 불산을 이용하여 퇴적물내 유기물 등의 미세입자들뿐만 아니라 패각을 제거하여 시스트 검경에 효율적이지만(Dale 1979), 산 처리에 의해 저항성이 약한 calcareous-walled 시스트의 형태가 변형되어 시스트 분포를 파악하는데 어려움이 있다(e.g. Shin et al. 2013). 반면, 산을 이용하지 않는 sieving method은 calcareous-walled 시스트를 관찰할 수 있는 장점이 있지만, 시스트 주변에 붙어있는 미세 먼지뿐만 아니라 퇴적물 속의 이매패류 파편과 유기물이 충분히 제거되지 않아 세포를 관찰하는데 많은 어려움이 있다(Kang et al. 2008). 퇴적물내 와편모조류 시스트는 오랜 시간 높은 열과 압력을 받아 시스트의 형태가 변형되었을 가능성이 있으며(Head et al. 2006), 특히 저항성이 약한 calcareous-walled 시스트는 형태가 변형되었을 가능성이 높다(e.g. Dale 1983). 이러한 두 기법의 차이와 퇴적물 시료에서 형태변이를 일으키는 와편모조류 시스트의 특성 때문에, 효율적인 퇴적물 전처리 방법 구축은 중요하다. 2000년대 초반 Cho et al. (2004)에 의해 동중국해 북부해역과 한국 남해안의 표층퇴적물에서 시스트 분포 특성을 알아보기 위해 palynological method을 이용하여 퇴적물을 처리하여 시스트 분포를 조사하였을 때, S. bulloideus가 전체 시스트 군집의 제1 우점종으로 나타났으며, 쿠로시오 기원수의 영향을 받는 제주도 남동쪽의 해역에서는 낮은 시스트 농도가 나타난다고 보고하였다. 하지만 본 연구에서는 산 처리를 하지 않는 sieving method을 이용하여 과거 조사해역과 유사한 동중국해 북부해역과 한국 남해안 해역의 시스트 분포를 조사해본 결과, Cho et al. (2004)에 의해 조사되었던 결과와 다른 시스트 분포 패턴을 보였는데, calcareous-walled 시스트인 T. heimii가 전체 시스트 군집에서 제 1 우점종을 차지한 반면 Spiniferites spp.는 낮게 나타났다. 이는 앞서 언급하였듯이 calcareous-walled 시스트는 산 처리로 인해 시스트 형태가 변형되어 동정이 되지 않았거나, 시료의 전처리 과정에서 산에 의해 용해 되어 나타난 결과로 판단된다. 또한 본 연구에서 동중국해 북부해역과 제주도 해역의 퇴적물로 sieving method과 palynological method을 통해 시료를 처리한 결과, palynological method의 방법보다 sieving method의 방법을 이용하여 시료를 처리하였을 때 더 다양한 와편모조류 시스트가 관찰되었으며, 더 높은 시스트 현존량을 보였다. Sieving method의 방법을 이용하여 시료를 처리하였을 때는 전체 군집에서 organic-walled 시스트는 낮은 우점율을 보였고, calcareous-walled 시스트는 높은 우점율을 차지하였다. 그리고 calcareous-walled 시스트의 T. heimii가 91.57%로 군집에서 제 1우점종으로 나타났다. 반면, palynological method의 방법을 통해 시료를 처리하였을 때는 전체 군집에서 calcareous-walled 시스트는 오직 한 정점에서만 출현하였고, organic-walled 시스트의 Spiniferites spp.가 52.89%로 가장 높은 우점율을 차지하였고 Brigantedinium spp.가 30.08%로 높게 나타났다. 이와 같이 동일한 퇴적물 시료이지만, 두 처리기법에서 종조성과 현존량이 차이가 발생하는 이유는 시료처리 과정에서 나타난 결과로 판단된다. 즉, 퇴적물 내 와편모조류 시스트를 관찰하기 위해 시료를 산 처리를 했을 경우, 스포로폴레닌 성분의 단단한 외벽을 가지고 있는 와편모조류 시스트는 저항성이 강하여 형태를 유지할 수 있지만(Dale 1979), 하지만, 산 처리로 낮아지는 pH에 의해 저항성이 약한 calcareous-walled 시스트는 용해되거나 혹은 형태가 변형 될 수 있기 때문에(Shin et al. 2013), 현미경에서 관찰되지 못하거나 오동정될 가능성이 있다. Shin et al. (2012)은 국내 연안에서 처음 Ensiculifera carinata의 시스트를 보고하였는데, 이전 연구에서는 퇴적물 시료의 산 처리로 인해 석회질 성분의 외벽이 용해되어 E. carinata를 관찰하지 못하였을 것이라 하였다. 그리고, Head et al. (2006)는 코어시료에서 나타난 organic-walled 시스트인 Alexandrium tamarense의 시스트는 Scrippsiella trifida의 시스트 외벽이 녹아 형태가 변형되어 동정을 잘못했을 것이라 하였다. 이처럼 palynological method을 이용하여 시료처리를 했을 때 낮은 종 다양성이 나타나는 이유는 산을 이용하여 시료를 처리하면 유기물뿐만 아니라 calcareous- walled 시스트의 형태 변형으로 인해 출현하는 시스트를 정확히 동정하고, 정량 하는데 어려움이 있기 때문이다. 따라서 표층퇴적물에서 나타나는 와편모조류의 시스트의 소실을 줄이고 정확한 종 다양성 확인을 위해서는 palynological method보다는 sieving method을 통한 시료의 처리와 관찰이 적절 한 것으로 판단된다.
