1. 서론
수환경의 생태계에서 저차생태계를 차지하는 미세조류는 빛 에너지를 통한 독립영양생물로써 수권환경에서 기초생산을 제공하는 중요한 역할을 한다. 더욱이, 최근에 다양한 산업적 분야에서도 적극 활용되고 있다(Park et al. 2008). 그 예로, 먹이생물로 활용되거나 가공 과정을 거쳐 동물 사료원으로서 제공되며, 미세조류의 세포 내 영양물질들을 추출하여 식품 및 의약품의 원료로 활용된다. Chlorella와 Spirulina 등은 아미노산과 항산화물질을 보충하는 건강기능식품으로 활용되고 있으며, Dunaliella의 경우 β-carotene과 Lutein이 많아 식품의 색소나 건강보조식품으로 활용하고 있다. 또한, 세포 내 지질은 바이오 디젤인 지방산 메틸에스테르로 전환이 가능하여(Ehimen et al. 2008), 화석연료를 대신할 대체에너지로 각광 받고 있으며, 세포 내 탄수화물을 전환시켜 바이오에탄올을 추출하기도 한다. 마지막으로 미세조류의 영양염 이용성 및 광합성에 따른 산소공급 기능을 활용한 생활 및 산업폐수 및 슬러지 정화의 이용도 있다. 실제 옥외 배양한 미세조류를 활용하여 도시하수 내의 부영양화 물질을 최대 97%까지 제거 가능하다는 보고가 있는 등(Kang et al. 2012), 다양한 산업분야에서 미세조류가 활용되고 있으며, 범위도 점차 확대 되고 있는 실정이다.
이러한 미세조류의 상업적 이용을 위해서는 단기간 내에 높은 농도의 세포밀도가 요구되기 때문에 대량배양이 필수적이다. 대량배양의 효율성을 높이기 위해 수온, 광 조건, pH, 염분 및 영양염 상태와 같은 무기 환경 요소를 조절할 필요가 있지만(Mchugh 2003; Park et al. 2010), 수온과 염분과 같은 환경요인의 조절은 배양액을 보충하거나, 조절을 위한 추가적인 장치가 필요하다. 이에 반해 광의 파장과 광량은 간단히 제어가 가능하며, 조절을 위해 큰 에너지가 불필요하기 때문에 배양 효율성을 높일 수 있다. 하지만 미세조류의 생장에 최적인 광량을 파악하지 못하면, 필요하지 않는 잉여의 광이 조사되기 때문에 에너지 손실과 종에 따라서는 광저해 현상을 초래할 수 있어, 생산성 저하가 나타날 수 있다. 광 파장의 변화도 미세조류의 다양한 광합성 색소 반응성에 의해 세포 내 생화학적 조성 및 함유량을 변화시켜 생산성을 높일 수 있어, 유용물질 증대 등 산업적인 분야도 많은 활용이 기대되고 있다(Mouget et al. 2004; Saavedra and Voltolina 2006; Oh et al. 2015). 따라서 광에 대한 미세조류의 생리 특성 이해는 대량배양 및 산업적 응용에 있어 중요한 요인으로 작용하기 때문에 활발한 연구가 필요하다.
본 연구에서 사용된 미세조류는 담녹조강에 속하는 Tetraselmis로 광합성색소로 chlorophyll a (chl. a)와 보조색소로 chl. b 그리고 카르티노이드 계열의 색소등을 함유하고 있다. 광온‧광염성의 특성이 있어 대량 배양에 용이하며, 먹이생물 선택 시 중요한 영양성분인 단백질 함량이 다른 미세조류에 비해 비교적 높아, 패류나 윤충의 먹이생물로도 활용되며, 영양염 흡수력이 좋아 수질정화를 위한 대상종으로도 이용되고 있다(Kim and Hur 1998). 이러한 장점으로 인해 발광다이오드(Light Emitting Diode; LED)를 활용한 대량배양에 대한 연구가 수행되고 있지만, 연구자에 따라 동일 속 및 종에서조차 광에 대한 생리적 특성이 크게 다르게 보고되고 있다(Teo et al. 2014; Schulze et al. 2016). 발광다이오드(LED)를 광량과 파장을 이용하여 단기간 내 고밀도의 대량배양과 함께 영양물질 증진효과를 위해 영양염 흡수에 대한 정보가 필요하며, 적절한 파장에 대한 광량이 조사가 된다면, 일반적인 고농도 배지가 아니더라도 충분히 높은 생장과 영양염 흡수를 기대할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 LED 파장에 따른 영양염 성분 중에서 미세조류에 가장 친화성이 높을 것으로 기대되는 암모니아염에 대하여 흡수능력 및 친화성을 파악하고, 이를 바탕으로 단일 특정 파장에 따른 Tetraselmis 속의 대량 배양의 가능성을 설명하였다.
2. 재료 및 방법
2.1 배양주 및 배양조건
실험에 사용된 Tetraselmis suecica (LIMS-PS-0007), T. tetrathele (LIMS-PS-0053)는 한국해양과학기술원 해양시료도서관에서 분양받았다. 배양에 사용된 배지는 남해 외양수를 바탕으로 한 f/2이며, selenium (H2SeO3) 최종농도를 0.001 μM이 될 수 있게 첨가하였다. 유지배양을 위한 수온과 염분은 20℃, 30 psu였고, 광량은 100 μmol/m2/s (L:D = 12L:12D; Cool-white fluorescent lamp)으로 조절하였다. 실험종의 무균처리를 위해 AM9 항생제를 이용하였고, 실험에 사용된 기구는 2차적인 생물학적 오염을 차단하기 위해 고온‧고압‧멸균(121℃, 202 kpa, 20 min)후 사용하였으며, 모든 실험은 Clean bench에서 수행되었다.
2.2 암모니아염 흡수 실험
Eppley et al. (1969)는 16종의 미세조류에 대해 영양염 흡수속도를 구하였다. 그 결과, 미세조류의 영양염 흡수는 기본적으로 해수 중의 영양염 농도에 의존하지만, 세포 내에서 영양염 pool을 가지는 경우에는 그 pool의 크기에 따라 달라진다고 보고하였다. 따라서 미세조류의 흡수속도와 영양염 농도 간의 관계를 파악하기 위해서는 영양염 첨가 후 정속 흡수(Surge uptake)를 보이며 세포 내 영양염의 변화가 없는 시간 내에 실험을 수행하여야 한다(Harrison et al. 1989). 따라서 영양염 흡수 실험을 하기 전에 사전실험을 통해 정속흡수를 파악하였다.
우선, 세포 내 질소를 고갈시키기 위해 질소가 제외된 AK 인공해수를 기반으로 한 L1배지에서 T. suecica와 T. tetrathele를 전 배양하였다. 이후 세포의 생장이 정지할 때까지 배양을 실시하였고, 암모니아염 20 μM가 함유된 L1 배지 700 mL에 세포 내 질소가 고갈된 세포액을 각각 접종하였다. 배양개시(0분), 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180 그리고 240분에 각각 배양액을 채수하여 암모니아염을 측정하였다. 파장에 따른 변화를 파악하기 위해 형광램프(fluorescent lamp; 삼파장등, ㈜남영전구), 적색파장(λmax=630 nm), 황색파장(λmax=590 nm), 청색파장(λmax=450 nm)에서 100 μmol/m2/s하에서 동일한 실험을 하였고, 일정한 흡수속도를 보였던 시간을 영양염 흡수실험 시간으로 선택하였다.
암모니아염 흡수속도는 300 mL 배양용기에 1.0, 5.0, 10, 20, 50, 70 그리고 100 μM의 7단계로 조제된 L1배지에 질소와 인이 고갈된 세포액(약 1×104 cells/mL)을 각각 접종하였다. 배양시간은 사전실험에서 정속흡수를 보였던 시간으로 설정하였다. 특히, 질소가 고갈된 세포를 함유한 배양액을 첨가하면 흡수실험에 제공된 영양염의 농도보다 낮아지기 때문에, 접종 직후 배양액을 채수하여 농도를 확인하였다. 파장에 따른 영양염 흡수속도 파악을 위해 모든 파장에서 100 μmol/m2/s에서 실험을 수행하였다. 또한 모든 실험 샘플은 GF/F (공경; 0.7 μm) 여과지로 여과한 후, 여액을 분석 전까지 –75℃로 동결시켜 보전하였다.
영양염 흡수속도와 영양염 간의 관계를 파악하기 위해 Michaelis-Menten 식을 이용하였다. 그리고 변수값(Ks)은 측정된 실험값을 식 (1)에 대입하여 비선형 최소자승법을 이용하여 계산하였다.
ρmax: 암모니아염 최대 흡수속도(pmol/cell/hr)
Ks: 반포화상수(μM)
S: 암모니아염 농도(μM)
암모니아염의 분석은 비색정량법으로 암모니아염은 염기성 차아염소산용액과 산화반응하여 모노크롤아민을 생성하며, 페놀과 촉매인 니트로프러시트와 차아염소산에 의해 푸른색의 인도페놀이 생성된다. 이 인도페놀을 UV/Vis Spectrophotometer (640 nm)로 측정하였으며, 검량선식을 이용하여 암모니아염 농도를 계산하였다(Strickland and Persons 1972).
3. 결과 및 고찰
미세조류는 질소원 중 암모니아염을 소비한 후, 질산염을 소비하는데 질산염에 비해 암모니아염이 에너지 측면에서 이용이 유리하다. Gilbert et al. (2007)는 미세조류를 질산염과 암모니아염이 혼합된 배지에서 배양시켰을 때, 암모니아염을 먼저 소비하는 것을 확인하였다. 이는 암모늄 이온 형태의 질소원을 체내에서 이용할 수 있는데, 질산염을 이용을 위해서는 두 단계의 효소반응을 통한 환원과정(nitrate reductase, nitrite reductase)을 겪으면서 많은 에너지가 요구되기 때문에, 통상 미세조류는 암모니아염을 질소원으로 더 선호한다. 따라서 본 연구에서는 암모니아염을 이용하여, 질소원 흡수능을 파악하였다.
LED 파장별로 시간에 따른 암모니아염의 흡수속도는 배양시작(0분)부터 일정시간까지 정속흡수를 보인 후 흡수속도가 현저히 낮아지는 경향을 보였다(Fig. 1; t-test, p<0.05). T. suecica는 황색파장에서 30분으로 가장 길었으며, 형광램프, 적색파장, 청색파장에서는 동일하게 20분으로 나타났다. T. tetrathele는 황색 파장을 제외한 모든 파장에서 동일하게 10분으로 나타났고, 황색파장에서는 20분이었다. 파장별 정속흡수 속도는 적색파장에서 2.75 ~ 3.49 pmol/cell/hr로 가장 높았고, 형광램프, 청색파장, 황색파장 순으로 높게 나타났다(Table 1). Han and Oh (2018)은 적색파장에서 T. suecica와 T. tetrathele의 생장속도가 다른 파장영역보다 높았다고 보고하였으며, 이는 chl-a 외에도 녹조류가 함유하고 있는 보조색소 chlorophyll b (chl-b)에 따른 것으로 보인다고 보고하였다. 또한 규조류 Achnanthes lanceolata도 생장속도가 높았던 청색파장(60분)에서 형광램프, 적색파장, 황색파장(90분)보다 정속흡수속도가 짧게 나타났다(Kwon 2013). 따라서 정속흡수 시간 내에서 흡수속도는 파장에 따른 생장속도의 결과와 잘 일치하며, 생장속도가 빠른 파장에서 암모니아염에 대한 흡수 또한 증가 되는 것을 확인하였다. 이 결과를 토대로 정속흡수를 보인 시간을 암모니아 흡수실험을 위한 배양시간으로 선택하였고, 파장별 암모니아염의 농도에 따른 흡수속도 실험을 수행하였다.
Table 1.
Uptake rate and uptake time of T. suecica and T. tetrathele for ammonium short-term uptake experiments under different wavelengths.
질소원이 고갈된 T. suecica의 파장별 시간에 따른 배양액 중 암모니아염 의 농도변화를 살펴보면, 모든 파장에서 암모니아 질소 농도가 50 μM까지 증가함에 따라 흡수속도 역시 증가하였고, 그 이상의 농도에서는 유사한 경향을 보였다(Fig. 2). Michaelis-Menten식에서 도출된 ρmax의 경우, 적색파장에서 가장 높았으며, 청색파장, 형광램프, 황색파장 순으로 나타났다(Table 2). Ks는 영양염에 대한 친화성의 척도로, 낮은 값을 보일수록 저농도의 영양염 조건에서 생장에 유리한 특성을 보이는데, T. suecica의 Ks도 적색파장이 다른 파장의 평균보다 약 1.5배 낮았고, 나머지 파장에서는 11.5 ~ 15.5 μM (평균 14.5±2.68 μM)의 범위를 보였다(Table 2). 질소원이 고갈된 T. tetrathele의 파장별 시간에 따른 배양액 중 암모니아 질소의 농도변화도 모든 파장에서 암모니아염 농도가 70 μM까지 증가함에 따라 흡수속도 역시 증가하였으며, 그 이상의 농도에서는 유사한 경향을 보였다(Fig. 2). ρmax의 경우, 형광램프와 적색파장에서 가장 높았으며 청색파장 그리고 황색파장 순으로 나타났고, Ks는 적색파장, 형광램프, 청색파장 그리고 황색파장 순으로 낮게 나타났다(Table 2). 따라서, T. suecica와 T. tetrathele는 생장이 빨랐던 적색파장에서 암모니아 질소의 흡수속도가 높았으며, 친화성도 다른 파장에 비교하여 우수한 것으로 나타났다.
Table 2.
The kinetic parameters for ammonium of T. suecica and T. tetrathele.
이러한 결과는 Han and Oh (2019)에서도 같은 종으로 인산염에 대한 LED 파장에 대한 친화성을 살펴본 결과와 일치하였는데, 적색 LED에서 다른 파장보다 인산염에 대한 친화성이 높았다. 또한, 경제성 및 생산성 향상을 위한 Tetraselmis 배양시스템(광배양기)의 최적 광원은 낮은 영양염 상태에서도 높은 생장속도를 보이는 적색 LED가 적합할 것으로 설명하였다. 더욱이 적색파장에서 생장효율이 높다는 보고는 녹조류(Chlorella pyrenoidosa, C. vulgaris, Haematococcus pluvialis, Scenedesmus sp. 등), 남조류(Spirulina platensis, Synechococcus sp. 등) 그리고 일부 거대조류(Porphyra 등)가 보고되어 있다(Lee and Palsson 1994; Figueroa et al. 1994; Takano et al. 1995; Katsuda et al. 2004; Xue et al. 2011; Oh et al. 2015). 대표적으로 Tetraselmis sp.의 보유하고 있는 색소조성을 살펴보면, Chl. a와 b가 대부분을 차지하며, caroteniod계열의 lutein, neoxanthin과 violaxanthin 등의 보조색소로 구성되어있다(Pereira et al. 2019). caroteiod계의 흡수파장대역은 400-600 nm이지만, Chl. b는 본 연구에서 사용한 적색 LED 주파장대와 유사한 660 nm의 파장을 흡수하여 작용중심으로 광 에너지를 전달한다(Pullin et al. 1979). 이처럼 적색파장을 효율적으로 흡수할 수 있는 보조색소의 보유로 적색파장을 생장 및 영양염 흡수에 효율적으로 이용할 수 있는 것으로 보인다.
이러한 적색파장에서 높은 흡수 및 친화성의 광특이성을 활용하여, 산업적으로 이용하려는 시도가 이루어지고 있다. 적색 LED를 이용하여 D. salina를 배양하면 β-carotene의 함량을 증진 시킬 수 있으며(Fu et al. 2013), 적색파장에서 Tetraselmis sp.와 Nannochloropsis sp.를 배양할 경우, 불포화 지방산으로 콜레스테롤 저하, 뇌기능 촉진 등 각종 질병 예방에 효과가 있는 Eicosapentaenoic acid와 oleic acid가 단위 세포당 높은 함량으로 생성된다(Das et al. 2011; Abisusi et al. 2013). 더욱이 Kwon et al. (2017)은 중금속 오염토에서 구리(Cu)와 아연(Zn)의 친환경적인 제거를 위해 다수의 미세조류를 이용하여 흡수 및 흡착능을 조사한 결과, 적색파장에서 C. vulgaris가 다른 미세조류와 파장보다 월등한 제거능을 가진다고 보고하였다. 따라서 녹조류와 남조류에 대해서는 적색파장이 먹이생물을 위한 대량배양 뿐만 아니라, 세포내 생화학적인 조성을 변화시키는 영양·보건학적으로 유용한 광원일 가능성이 있어, 향후 다양한 광량과 점멸(flshing) 방식에 따라 달라지는 본 종의 생화학적 조성의 차이를 살펴볼 필요가 있을 것으로 생각된다.
4. 결론
미세조류의 대량배양 시 광 조건을 통한 제어는 다른 환경변수 항목인 수온, 염분 그리고 영양염 제한 등보다 용이하며, 특히 파장을 통해 생산효율을 높일 수 있다. 하지만 개방형 배양의 경우, 야외에서 수행되기 때문에 계절 및 기상여건에 따른 환경조건을 유지해주기 어렵다. 또한 태양광을 이용하여 배양을 진행하기 때문에 미세조류에 요구되는 보상광량과 최적생장광량을 맞추기 어려워, 산업적 이용을 위해서는 많은 제약이 따른다. 인공광원을 사용하는 밀폐형 배양시스템의 경우, 이러한 환경변화에 제약이 없다는 장점을 가진 시스템으로 LED의 선택적 사용에 따라 배양효율을 극대화할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 LED는 낮은 소비전력으로 인하여 같은 광량이라도 형광램프에 비하여 소비전력이 낮아, LED파장과 형광램프가 비록 같은 생장속도와 영양염 흡수속도를 보이더라도, 장기적으로는 LED 배양기 시스템이 경제적인 효과가 크게 나타날 수 있다. 따라서 본 연구의 결과와 같이 Tetraselmis 속의 대량배양의 경우, 적색파장은 영양염에 대한 높은 친화성을 나타내었기 때문에, 비교적 낮은 영양염 농도에서도 높은 생장속도를 보일 수 있어, 저비용 고효율의 배양법을 수립할 수 있는 기초자료가 될 수 있을 것으로 기대된다.
